En 1987 un artículo describía cómo algunas bacterias (Streptococcus pyogenes) se defendían de las infecciones víricas. Estas bacterias tienen unas enzimas que son capaces de distinguir entre el material genético de la bacteria y el del virus y, una vez hecha la distinción, destruyen al material genético del virus. Sin embargo, las bases de este mecanismo no se conocieron hasta más adelante, cuando se mapearon los genomas de algunas bacterias y otros microorganismos. Se encontró que una zona determinada del genoma de muchos microorganismos, sobre todo arqueas, estaba llena de repeticiones palindrómicas (que se leen igual al derecho y al revés) sin ninguna función aparente. Estas repeticiones estaban separadas entre sí mediante unas secuencias denominadas “espaciadores” que se parecían a otras de virus y plásmidos. Justo delante de esas repeticiones y “espaciadores” hay una secuencia llamada “líder”. Estas secuencias son las que se llamaron CRISPR (“Repeticiones Palindrómicas Cortas Agrupadas y Regularmente interespaciadas”).
CRISPR está causando una gran conmoción en la investigación biomédica. A diferencia de otros métodos de edición de gen, es barato, rápido y fácil de usar, por lo que se ha extendido en los laboratorios de todo el mundo. "He visto dos enormes avances desde que he estado en la ciencia: CRISPR y PCR," dice John Schimenti, genetista de la Universidad de Cornell en Ithaca, Nueva York. El CRISPR es el descubrimiento más revolucionario desde los años 80, cuando el bioquímico estadounidense Kary Banks Mullis desarrolló la técnica de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), que amplifica de forma importante cualquier forma de ADN y que transformó los laboratorios de biología y de genética de todo el mundo. El investigador científico del Centro Nacional de Biotecnología del CSIC, Lluis Montoliu, aseguraba hoy a EFE que la técnica CRISPR para la edición genética es una "revolución irreversible que viene para quedarse".
La tecnología CRISPR es una herramienta molecular utilizada para “editar” o “corregir” el genoma de cualquier célula. De manera similar a una "tijera genética" son capaces de cortar cualquier molécula de ADN de forma muy precisa y totalmente controlada, lo que permite modificar su secuencia, eliminando o insertando un nuevo ADN. Es decir, esta herramienta puede ser utilizada para regular la expresión génica, etiquetar sitios específicos del genoma en células vivas, identificar y modificar funciones de genes y corregir genes defectuosos. También se está ya utilizando para crear modelos de animales para estudiar enfermedades complejas o para curar enfermedades cuya causa genética se conozca y que hasta ahora eran incurables mediante terapia génica.
Un poco más de historia.
En el año 1993 el científico español Francisco J. M. Mojica de la Universidad de Alicante publica el resultado de sus investigaciones con las bacterias arqueas halófilas (capaces de vivir en medios con unas concentraciones de sales extremadamente elevadas). Mediante la secuenciación de parte del genoma de la arquea identifica unas secuencias palindrómicas de 30 pares de bases separadas entre sí por fragmentos de 36 pares de bases, los denominados espaciadores. Mojica y sus colaboradores detectan, buceando en bases de datos, un gran número de estas secuencias repetidas en bacterias, arqueas y mitocondrias y proponen el nombre de Short Regularly Spaced Repeats (SRSR) (Repeticiones Cortas Regularmente Espaciadas). Posteriormente se decidió cambiar el nombre por Clustered Regularly Interspaced Short Palyndromic Repeats (CRISPR) (Repeticiones Palindrómicas Cortas Agrupadas y Regularmente Interespaciadas)
En el año 2002 en una publicación de microbiólogos holandeses se describen por vez primera un conjunto de genes asociados a las secuencias repetidas CRISPR (los genes cas o asociados a CRISPR). En el 2005, tres grupos de investigación independientes muestran que algunos de los espaciadores de los CRISPRs se derivan de diversas fuentes de ADN como ADN de virus bacteriofagos y ADN extracromosomal como los plásmidos. El grupo de investigación de Francisco J. Mojica intuye que las secuencias CRISPR y los espaciadores asociados, pueden formar parte de algún sistema inmune propio de estos microorganismos procarióticos. Por otro lado Alexander Bolotin, del Instituto Francés de Investigación Agronómica descubre en la bacteria Streptococcus thermophilus que carecen de algunos de los genes cas conocidos y en su lugar contiene nuevos genes cas, incluyendo uno que codifica una proteína que predice que tienen actividad de nucleasa, lo cual ahora se denomina como Cas9.
El científico Eugene Koonin del Centro Nacional de Información sobre Biotecnología de Estados Unidos estudia en el 2006 grupos de proteínas por análisis computacional y propone un esquema para cascadas de CRISPR que funcionan como sistema inmune bacteriano, basado en inserciones homólogas al ADN del virus. En el año 2007, el investigador Philippe Horvath (perteneciente a la industria alimenticia en la empresa Danisco) y el grupo de Moineau en la Université Laval de Canadá muestran que es posible alterar la resistencia de Streptococcus thermophilus a ataques de fagos gracias al ADN espaciador. En 2008 el científico John van der Oost, de la Universidad de Wageningen en los Países Bajos, demuestra que en la bacteria coli E-Scherichia , las secuencias espaciadoras, que se derivan de fago, se transcriben en ARN, denominado ARN CRISPR (crRNAs), que guía a las proteínas Cas hacia el ADN objetivo. Por otro lado Luciano Marraffini y Erik Sontheimer, de la Northwestern University en Illinois demuestran que las moléculas objetivo son el ADN en lugar del ARN como se pensaba hasta entonces y señalan que este sistema puede convertirse en una poderosa herramienta que transferir a sistemas no bacterianos.
En 2009 el investigador Sylvain Moineau, de la Universidad de Laval en Quebec demuestra que CRISPR-Cas9 crea roturas de doble cadena de ADN diana en posiciones precisas y también confirma que Cas9 es la única proteína necesaria para la escisión en el sistema de CRISPR-Cas9. La investigadora Emmanuelle Charpentier de la Universidad de Umee realiza en 2011 una pequeña secuenciación de ARN en Streptococcus pyogenes que contiene un sistema de CRISPR-Cas9 y descubre que además de la crRNA, existe un segundo ARN que llama trans-activación de CRISPR ARN (tracrRNA). Además demuestra que tracrRNA actúa conjuntamente con el crRNA para guiar a Cas9 hacia sus objetivos.
Aunque sin duda estas investigaciones fueron importantes para el desarrollo de la técnica, no fue hasta el año 2012 en el que se dio el paso clave para convertir este descubrimiento en una herramienta molecular útil en el laboratorio. En agosto de este año un equipo de investigadores dirigido por las doctoras Emmanuelle Charpentier en la Universidad de Umeå y Jennifer Doudna, en la Universidad de California en Berkeley, publicó un artículo en la revista Science el que se demostraba cómo convertir esa maquinaria natural en una herramienta de edición “programable”, que servía para cortar cualquier cadena de ADN in vitro. Es decir, lograban programar el sistema para que se dirigiera a una posición específica de un ADN cualquiera (no solo vírico) y lo cortaran.
¿Y ahora qué hacemos con CRISPR?
Poco después del famoso artículo de Doudna y Charpentier, en enero de 2013 los laboratorios de George Church en Harvard y Feng Zhang en el Broad Institute del MIT fueron los primeros en publicar artículos demostrando que CRISPR/Cas9 servía para células humanas. Doudna publicó lo propio de manera independiente apenas unas semanas más tarde.
Al MIT (Instituto Tecnológico de Massachussets) anunció ya en marzo de 2014 que había conseguido curar a un ratón adulto de una enfermedad hepática (tirosinemia de tipo I) de origen genético utilizando esta tecnología y en apenas tres años la técnica ya se ha trasladado a la clínica. El pasado año se trató en China a un paciente desahuciado de cáncer al cual se le extrajeron células de su sangre, con las herramientas CRISPR se desactivó un gen con la esperanza de que pudiera reaccionar mejor al cáncer y se lo volvieron a introducir, aunque todavía no se conoce el resultado.
Científicos de la Universidad de California en Irvine presentaron en noviembre de 2016 mosquitos modificados genéticamente para que no puedan transmitir la malaria. El objetivo es poder liberar este tipo de mosquitos modificados genéticamente en regiones donde la malaria es endémica, para que se puedan aparear con mosquitos silvestres y transmitir el gen de resistencia a la infección a las generaciones siguientes, con lo que se puede llegar a conseguir que los casos de malaria se reduzcan enormemente.
Investigadores de la Escuela de Medicina de la Universidad de Harvard han logrado eliminar genes dañinos de cerdos con el objetivo de trasplantar los órganos de los animales a personas. Para ello es necesario eliminar las marcas genéticas del animal que causarían rechazo en los receptores humanos. Uno de los logros conseguidos es limpiar el genoma del animal de enterovirus porcino, presente en todas sus células y que, aunque inocuo para el animal, infectaría las células humanas en el momento en que se trasplantase material genético del cerdo a una persona.
Ingenieros del MIT trabajan en un método convertir a las superbacterias o bacterias resistentes a los antibióticos en armas contra sí mismas. La mayoría de los antibióticos actúan al interferir con las funciones esenciales de la bacteria, como la división celular o la síntesis de proteínas, pero algunas bacterias, como MRSA (Staphylococcus aureus resistente a la meticilina) y organismos CRE (enterobacterias resistentes a carbapenem), han evolucionado hasta convertirse en prácticamente intratables con los medicamentos existentes. Gracias a CRISPR es posible controlar los genes específicos que permiten a las bacterias sobrevivir al tratamiento con antibióticos.
Investigadores de la Rockefeller University están trabajando en un antibiótico más inteligente. Estos antimicrobianos selectivos están programados para dirigirse selectivamente a las bacterias malas, concretamente a aquellas que albergan genes de resistencia a antibióticos, mientras que dejan sin aniquilar a los microbios inocentes que además pueden resultar beneficiosos para nuestra salud.
En Agricultura al igual que ocurre en el ámbito de la medicina, son muchas las aplicaciones que se están pensando para la tecnología CRISPR, ya que del mismo modo se puede utilizar para luchar contra las enfermedades que atacan a las plantas y los animales de los que nos alimentamos, e incluso mejorarlos para que su consumo pueda resultar más beneficioso para nosotros. A todo esto hay que añadir las ventajas que tiene la mejora genética de plantas y animales, en lo que se refiere a la posibilidad de reducir el uso de productos químicos como los fertilizantes y fitosanitarios usados en agricultura, además de evitar el uso de medicamentos para tratar las enfermedades del ganado, que de esta forma se podrían eliminar con las ventajas que ello conlleva para el medio ambiente y para nuestra salud, al eliminar sustancias que puedan resultar tóxicas para las personas. Ejemplo de ello es el trabajo que realiza investigador chino Gao Caixia al aplicar esta tecnología para la creación de una cepa de trigo resistente a la enfermedad del oídio. A esta cepa le faltan genes que producen proteínas que reprimen las defensas en contra del oídio, para ello se borraron todas las copias de los genes del genoma hexaploide del trigo. Gracias a esta nueva cepa de trigo se espera reducir o eliminar el gran uso que se suele hacer de fungicidas para controlar la enfermedad. Para conseguirlo se han utilizado los sistemas de edición génica TALENs y CRISPR. Otra aplicación de esta tecnología en agricultura la encontramos en el trabajo que realiza el un científico Yinong Yang que ha utilizado la técnica de edición genética CRISPR para cortar varias letras de ADN del genoma del champiñón Agaricus bisporus de forma que se ha podido eliminar una encima que los vuelve de color marrón en lugar del color blanco que lo caracteriza.
En Alimentación gracias a la tecnología CRISPR se están creando factorías microbianas, para producir alimentos, que no se vean afectadas por los ataques víricos, al estar vacunadas contras los virus. Streptococcus thermophilus es una bacteria que ha sido domesticada por el hombre y que ha sido utilizada desde principios del siglo XX en la elaboración de quesos y yogur. Estas bacterias son atacadas con frecuencia por virus bateriófagos que pueden arruinar por completo la producción de estos alimentos. Precisamente los investigadores de la empresa de alimentación Danisco han jugado un papel fundamental en el desarrollo de la tecnología CRISPR, encontrando a su vez una solución a los propios problemas a los que se enfrentaba esta industria. Igualmente esta tecnología resultará de gran utilidad para solucionar otras problemáticas a las que se enfrenta la industria alimentaria, ya sea a nivel de mejorar genéticamente las plantas o animales que producen las materias primas con las que se elaboran los alimentos, o a la hora de luchar contras las plagas y enfermedades que tienen estas plantas y animales.
Startups que trabajan utilizando la tecnología CRISPR
En abril de 2014 Zhang y el Instituto Broad obtuvieron la primera de entre varias patentes generales que cubren el uso de CRISPR en eucariotas. Eso les otorgaba los derechos para usar CRISPR en ratones, cerdos, humanos… prácticamente en cualquier criatura que no fuera una bacteria. La velocidad de obtención de la patente sorprendió a algunos. Y fue porque el Instituto Broad había pagado de una manera discreta para que la revisaran muy rápido, en menos de seis meses. Además el proceso se llevó a cabo de una manera casi “secreta”. Junto con la patente llegaron más de mil páginas de documentos. Doudna había presentado antes que la de Zhang, una solicitud de patente. Pero, según Zhang, la predicción de Doudna en su solicitud de que su descubrimiento funcionaría en humanos era una “mera conjetura” y que en cambio él fue el primero en demostrarlo en un acto de invención distinto y “sorprendente”. Para demostrar que fue “el primero en inventar” el uso de CRISPR-Cas en células humanas, Zhang presentó fotos de cuadernos de laboratorio que según él demuestran que tenía el sistema en marcha a principios de 2012, incluso antes de que Doudna y Charpentier publicaran sus resultados o solicitaran su propia patente. Esa cronología significaría que él descubrió el sistema CRISPR-Cas independientemente. En una entrevista, Zhang afirmó que había hecho los descubrimientos él solo. Al preguntársele qué había aprendido del artículo de Doudna y Charpentier, dijo “no mucho”.
En el juego de las patentes aparecen implicadas tres start-up para las que el control de esas patentes es clave. Entre esas empresas están Editas Medicine, Intellia Therapeutics, ambas de Cambridge, y CRISPR Therapeutics, una start-up de Basilea (Suiza) cofundada por Charpentier pero cada vez hay más voces que piden que, debido a la gran capacidad de curar enfermedades, la tecnología no quede protegida por patente y se deje como acceso público. La propia Charpentier asegura que la tecnología ha sido puesta libremente a disposición de la comunidad investigadora, por lo que no cree que la patente suponga ningún obstáculo al avance científico.
El panorama actual de los derechos de esta tecnología es, al contrario de lo que sucede cuando hablamos de otras donde son grandes empresas las que tienen una predominancia en el mercado, en el caso del desarrollo de la tecnología CRISPR-Cas9 y su posterior comercialización, nos encontramos que son startups las que se han posicionado como líderes:
- Caribou Biosciences cuenta con los derechos comerciales de los patentes que ha solicitado la Universidad de California en Berkeley de CRISPR-Cas9. La empresa fundada como una spin-off de la universidad, por Jennifer Doudna, Martin Jinek, Rachel E. Haurwitz y James Berger, cuenta con más de 44 millones de dólares de inversión y entre sus inversores están importantes fondos de Venture Capital y la empresa farmacéutica Novartis.
- Editas Medicine fundada en 2013 por Jennifer Doudna, Feng Zhang y J. Keith Joung, ha realizado rondas de inversión por valor de 210 millones de dólares y comenzó a cotizar en el Nasdaq en febrero de 2016, contando actualmente con un valor superior a 600 millones de dólares. Entre su actividad encontramos por ejemplo el trabajo con la compañía inmunoterapéutica Juno Therapeutics para crear terapias de células inmunológicas anticancerosas.
- Intellia Therapeutics fundada en 2014 ha realizado dos rondas inversión por valor de 85 millones de dólares y cotiza en bolsa desde mayo de 2016, contando actualmente con una valoración de 466 millones de dólares. La empresa también cuenta entre sus fundadores con la investigadora Jennifer Doudna y entre sus inversores con las empresas Caribou Biosciences y Novartis, con la que realiza actividades de investigación y desarrollo para el uso de CRISPR ex vivo para la ingeniería de células T con un quimérico receptor de antígeno (CART) y precursores hematopoyéticos (HSC).
- CRISPR Therapeutics fundada en 2013 en Londres por Emmanuelle Charpentier, Rodger Novak, , Craig Mello, Chad Cowan, Matthew Porteus y Daniel Anderson, ha recibido 127 millones de dólares en 3 rondas de inversión y cotiza en bolsa desde octubre de 2016 contando actualmente con un valor de 905 millones de dólares.
- ERS Genomics es la empresa creada para comercializar la propiedad intelectual CRISPR-Cas9 de la co-inventora y co-propietaria de la patente Emmanuelle Charpentier.
Entre los fundadores de estas startups encontramos a algunos de los científicos que han jugado un papel más relevantes en los descubrimientos que permitieron diseñar la tecnología de edición genética CRISPR-Cas9, de forma que toman el protagonismo no solo a nivel de investigación sino también a nivel de negocio, explotando el uso de las patentes que se han generado y pudiendo formar parte de los desarrollos comerciales que se vayan a realizar en el futuro, basados en la aplicación de esta tecnología en ámbitos como la salud y la alimentación.
Otras startups a tener en cuenta si te interesa conocer la aplicación a nivel de negocio de la tecnología CRISPR son: Sangamo BioSciences que investiga, desarrolla y comercializa proteínas ligantes de ADN diseñadas para el desarrollo de nuevas estrategias terapéuticas; Atum que se dedica al desarrollo de herramientas para la edición y la ingeniería del genoma, Precision Biosciences que se dedica a la edición del genoma en un esfuerzo por superar el cáncer, curar enfermedades genéticas y permitir el desarrollo de fuentes de alimentos más seguras y productivas; ToolGen es una empresa coreana que se dedica a utilizar CRISPR-Cas9 para distintas aplicaciones de ingeniería genética; Ovascience que se dedica al desarrollo y comercialización nuevos tratamientos de fertilidad para mujeres; Calyxt que utiliza esta tecnología con el objetivo de crear alimentos que resulten más saludables para las personas; Bluebird Bio que desarrolla productos que abarcan la terapia génica, la inmunoterapia contra el cáncer y la edición de genes, proporcionando el potencial para tratar y curar una amplia gama de enfermedades graves; E-Gensis es una empresa creada por el científico George Church para explotar comercialmente los resultados de las investigaciones que realiza para aplicar la tecnología CRISPR en la utilización de cerdos como fábricas de órganos para trasplantes a humanos; Recombinetics utiliza las tecnologías de edición del genoma que no permiten realizar alteraciones genéticas precisas: TALENs y CRISPR-Cas9.
Las grandes empresas de la industria farmacéutica han visto en CRISPR una gran oportunidad para mejorar sus productos, por lo que se han lanzado a investigar en este ámbito y sobre todo a colaborar con las startups que cuentan con las patentes de la tecnología, fruto de los descubrimientos realizados en los centros de investigación. A continuación podemos conocer algunas de estas grandes empresas y parte del trabajo que están realizando.
Novartis comenzó a colaborar a principios de 2015 con las empresas Intellia Therapeutics y Caribou Biosciences para la elaboración de medicamentos y herramientas para el descubrimiento de fármacos con la técnica CRISPR de modificación genética.
AstraZeneca ha llegado a acuerdos con el Instituto Wellcome Trust Sanger, la Iniciativa Innovative Genomics, y los Institutos Broad and Whitehead de Massachusetts, y Thermo Fisher Scientific para utilizar la tecnología CRISPR en la identificación y validación de nuevos objetivos en modelos preclínicos en una variedad de enfermedades.
En diciembre de 2015, Bayer y CRISPR Therapeutic crearon una joint venture denominada Casebia Therapeutics, para el desarrollo de líneas de investigación y de fármacos en las áreas de enfermedades sanguíneas, ceguera y problemas cardíacos congénitos. La empresa tiene acceso a la tecnología de edición de genes de Crispr Therapeutics para zonas especiales en enfermedades, así como a los conocimientos de ingeniería de proteínas y enfermedad relevante por intercambio de tecnologías de Bayer.
Otras farmacéuticas que trabajan con la tecnología CRISPR son: Juno Therapeutics que cuenta con un acuerdo con la startups Editas para crear terapias de células inmunológicas anticancerosas; Vertex Pharmaceuticals que ha realizado un acuerdo con Crispr Therapeutics que podría ser valorado en 2.600 millones de dólares; Regeneron Pharmaceuticals que dispone de un acuerdo de licencia de patente con ERS Genomics y una colaboración valorada en 75 millones de dólares, para trabajar con Intellia Therapeutics en el desarrollo de estas tecnologías.
Por otro lado nos encontramos a las empresas que aplican la biotecnología en el sector agrícola donde destaca la actividad que realizan: DuPont que cuenta con una licencia para utilizar la tecnología CRISPR-Cas9 en una alianza de investigación con CIMMYT (Centro internacional de mejoramiento de maíz y trigo, con sede en Texcoco), para aplicar esa tecnología con el fin de crear maíces genéticamente manipulados. Para ello dispone de un acuerdo con Caribou Sciences, la spin-off del laboratorio de Jennifer Doudna, de la Universidad de California en Berkeley. La empresa lleva desde 2015 experimentando con el cultivo de plantas de maíz y trigo editadas genéticamente con CRISPR y se propone llevar al mercado los primeros productos dentro de un periodo de entre 5 y 10 años. Algunos de estos productos podrían ser una variedad de maíz resistente a las sequías y una variedad de trigo modificado genéticamente para que se cultive como un híbrido, en lugar de autopolinizarse. Las plantas híbridas son vigorosas, y su rendimiento puede aumentarse por el 10% o 15%. También Monsanto ha realizado una alianza con el Instituto Broad del MIT para disponer de una licencia no exclusiva para aplicaciones agrícolas de la tecnología CRISPR-Cas para su uso en el desarrollo de semillas.
¿Y en España qué?
El científico español Francisco J. M. Mojica, realizó una poartación de indudable valor sin la cual probablemente no habríamos llegado a una situación tan prometedora como la actual. Además, existe alguna iniciativa concreta que puede servir como punta de lanza para que nuestro país no se quede al margen de una tecnología que tanto puede hacer por ayudar a mejorar la vida de las personas.
En España el CSIC fue el primer laboratorio en aplicar las herramientas CRISPR para hacer modelos animales en el estudio de enfermedades raras, en concreto en la condición genética del albinismo, cuya mayor discapacidad es la visual. Breaking Cas es una herramienta online desarrollada en el Centro Nacional de Biotecnología del CSIC con el objetivo de facilitar el diseño de experimentos de edición génica utilizando la técnica CRISPR-Cas. Con esta aplicación se puede diseñar el ARN-guía necesario para la implementación de esta técnica y que ha de ser específico para cada experimento que se quiera realizar. El software ayuda a los investigadores a realizar la edición génica con CRISPR con cientos de genomas de cerca de 700 organismos eucariotas, que están contenidos en la plataforma Ensembl. Además la herramienta ayuda a minimizar las posibilidades de que se produzcan errores debido a cortes y ediciones del genoma en un puntos diferentes al deseado, del mismo modo que es posible ajustar las características de la enzima nucleasa utilizada, ya que, aunque la más común es Cas9, existe la posibilidad de utilizar otras proteínas.
Para finalizar os dejamos un enlace a este vídeo donde nos invitan además a reflexionar sobre la utilidad y futuro de la tecnología CRISPR.
Fuentes:
- CRISPR, la nueva revolución genética. LA VANGUARDIA.
- Everything You Need to Know About CRISPR, the New Tool that Edits DNA. Sarah Zhang
- La técnica CRISPR para editar genes: una revolución imparable, según el CSIC. LA VANGUARDIA.
- Especial CRISPR revista NATURE (http://www.nature.com/news/crispr-1.17547).
- El blog de BAYER. ¿Qué es la tecnología CRISPR?.
- Qué es CRISPR y por qué es tan importante para nuestro futuro. Futurizable. Javier Martín.
- ¿Qué es la tecnología CRISPR/Cas9 y cómo nos cambiará la vida?. DCiencia para Todos. Alberto Morán.
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